EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition)制御活性評価
(担当：井本正哉)
EMT（上皮間葉転移）は、上皮性のがん細胞が、より運動性の高い間葉系細胞の表現型を獲得し、転移を起こしやすくなった状態をいう。またEMTを起こした細胞は apoptosisに抵抗性になる。したがって、EMTを制御することは新しいがん治療戦略と考えられる。これまでTGF-βを中心としたEMTの検出系が知られており、さまざまなTGF-βシグナリングの制御物質にEMT阻害活性が報告されている。そこで、ここではEMTを起こしたがん細胞を上皮細胞の表現系に戻す活性(MET促進活性)に注目し、テスト化合物のMET促進活性を評価する。
【方法】
［概要］第１評価として，検体がTGF-βにより誘導されるLoVo細胞の細胞間接着消失を回復させるかを調べる．細胞間接着を回復させた検体について第２評価を行う．第２評価は検体がTGF-βにより誘導されるLoVo細胞のE-cadherin発現量減少を回復させるかを調べる．
［第１評価系］LoVo細胞を48ウェルプレートに播き，24時間後にTGF-βを添加する．48間培養後サンプルを添加し，さらに48時間後に細胞間接着の有無を顕微鏡観察にて調べる．陽性対照にはTGF-β RI阻害剤であるSB431542を用いる．
［第２評価系］LoVo細胞を6ウェルプレートに播き，24時間後にTGF-βを添加する．48時間培養後サンプルを添加し，さらに48時間後に細胞を回収する．その後抗E-cadherin抗体によるウェスタンブロットを行い，E-cadherin発現量回復率を評価する．陽性対照にはTGF-β RI阻害剤であるSB431542を用いる．
【活性の評価】
第１評価系では検体を最終濃度10 μMになるように添加し，細胞間接着の有無を判断する．細胞毒性が観察された場合は10 μMから4段階の3倍希釈系列を作り，再度細胞間接着の有無を判断する．第2評価系では10 μMから4段階の3倍希釈系列を作りE-cadherin発現量回復率を評価する．30 %以上回復させたものを有効と判断する